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    阅读次数:204  发布时间:2019/12/13 10:01:43
     赛默飞推出Q Orbitrap旗舰机Orbitrap Exploris™ 480已经有一段时间了,集结了LFQ, TMT10plex, TMT11plex, TMT16plex及TurboTMT, vDIA, HR-DIA, BoxCarDDA, BoxCarDIA, PRM及SureQuant等一系列定量功能,相信大家对其整体的定量性能充满好奇。

    本期我们将要带大家走入Exploris 480的定量之路

     

    1.Orbitrap Exploris 480质谱仪——精zhun的非标记定量

    FAIMS Pro可以通过多肽带电性质的不同分离肽段,从而作为一种在线的气态样品分级手段来提高复杂样品的定性和定量效率。Exploris 480搭载FAIMS Pro,数据分析采用Proteome Discoverer2.4,将FDR设置为1%,60min和120min可分别从1ug Hela全细胞酶解产物中鉴定近6300个和7300个蛋白(图1)。

     

    图1. Orbitrap Exploris™ 480 搭载FAIMS Pro的鉴定结果

     

    用全细胞酶解产物评估非标记定量的重现性亦得到很好的结果,三次重复的重现性高达97%,蛋白定量CV值低至5%(图2)。

    图2. Orbitrap Exploris™ 480非标记定量的重现性评估

     

    2.FAIMS Pro 接口——TurboTMT助力多重蛋白质组学研究

    10标以及11标的TMT定量凭借其“高产”的优势,一直备受欢迎。对于高于10标的TMT定量而言,相邻报告离子基团仅存在6mDa的质量差异,至少需要采用35,000的分辨率进行准确分辨,只能在Orbitrap平台上实现;另外,共流出肽段的干扰也会影响TMT-MS2定量准确性。因此,10标以及11标的TMT定量也一直受到扫描速度和共流出肽段干扰两个问题的困扰。针对这两个问题,Exploris 480上给出了完整的解决方案(图3)。

    图3. Orbitrap Exploris™ 480的TMT定量的性能评估

     

    Exploris 480的TurboTMT采用ΦSDM谱图后处理算法,当使用15,000分辨率采集数据时,报告离子处的分辨率达到了50,000,从而在保证区分质量亏损级差异的报告离子前提下提升扫描速度;Exploris 480搭载FAIMS Pro,基于价态在线分级可以缓解共流出肽段干扰的问题,从而提高定量准确度。TMT11标酵母标准品的结果也证明,Exploris 480结合Turbo-TMT和FAIMS Pro可显著提升了样品的定量深度和准确性(图4)。

    图4. Turbo-TMT和FAIMS Pro显著提升定量深度和准确性

     

    3.DIA分析方案

    随着蛋白质组学的进一步发展,尤其对于精zhun医学、临床大队列转化医学等研究,DIA分析策略也备受青睐。结合Orbitrap超高分辨质谱在蛋白质组学领域的技术优势,赛默飞在2018年ASMS上提出了基于微流液相和Orbitrap超高分辨质谱的数据非依赖采集工作流(HRMS1-DIA),采用超高分辨一级扫描定量策略(R>120,000)。

     

    我们使用已知组成的人、酵母、大肠杆菌混合样品,在11个实验室HRMS1-DIA工作流进行定量准确性和稳定性的长期多中心验证(图5)。各实验室平均可以鉴定到超过8000个蛋白,定量超过6000个蛋白,且定量准确度高于0.9。

    图5. HRMS1-DIA的长期多中心验证。

    A. 蛋白鉴定和定量数量;

    B. 实验室间的蛋白定量散点图;

    C.日间鉴定及定量蛋白的重现性

    4.BoxCar分析流程

    2018年Matthias实验室在Nature Methods上发表了全新的BoxCar采集方式,一级全扫采用分段累积合并扫描的方式,降低高丰度肽段对低丰度肽段的信号压制,提升一级扫描的动态范围,从而增加血浆等动态范围大的样本解析深度(图6)。

    图6. BoxCar工作流程示意图

     

     

    Exploris 480为客户提供更为便捷的BoxCar DDA 和BoxCar DIA 定量新方案(图7),极大的丰富了现有的定量流程。

    图7. Orbitrap Exploris™ 480质谱的BoxCar操作界面

     

     

    5.靶向定量的新思路b

    就如众多研究对高通量信息挖掘的需求一样,差异蛋白的高可信量化也至关重要。传统检测方法多基于免疫反应,常常会受到抗体的可获得性、特异性和稳定性的困扰。平行反应监测(Parallel Reaction Monitoring,PRM)是Orbitrap超高分辨系列仪器上独有的靶向定量方法,采用高分辨扫描,可有效排除复杂基质干扰。相比于传统的SRM和MRM,PRM采用高分辨二级全扫,无需优化碰撞能量,无需指定子离子,方法开发更加简单,是目前已被广泛运用的金标验证方法。

     

    与此同时,经常也会被问到的一个问题:一针采集中PRM能监测多少条肽段?基于2015年Gallien等人在MCP上发表的IS-PRM思路,Exploris 480上提供了更强健、更便捷的SureQuant定量新方法(图8)。

     

    图8. SureQuant定量新方法

     

    SureQuant IS 靶标分析250ng含有50fmol 内标的细胞酶解物,如图9所示,相比于PRM20%的生产力,SureQuant方法将生产力提高至80%;此外,SureQuant不依赖于预设保留时间,能够实现可靠稳定的靶标定量

     

    图9. SureQuant改善生产力(图9a)和保留时间漂移(图9b)的限制

     

     

    我们以AKT/mTOR通路分析作为一个例子,基于Capillary流速LC-MS平台,以Hela全蛋白酶解产物为样品,对AKT/mTOR通路中的12个蛋白/30条肽段进行PRM和SureQuant靶向定量分析。实验结果表明,SureQuant的肽段检出效率明显高于PRM(图10)。

     

    图10. SureQuant靶向监测酶解产物中AKT/mTOR 通路的内源肽段

     

    定量蛋白质组学完整解决方案

    Orbitrap Exploris480质谱仪作为全新一代Q Orbitrap系列旗舰机,具备ji佳的性能和重现性。拥有LFQ,TMT及TurboTMT,DIA、HR-DIA、BoxCar、PRM及SureQuant等多样化的定量解决方案,在同一台仪器上完成从大规模发现到靶向验证所有工作,是蛋白质组学、精zhun医学、生物制药等研究的不二选择。

     

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